多重化され、ペアになった

May 25, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3075 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

SARS-CoV-2 のパンデミックに対応して、当社は多重化ペアプール液滴デジタル PCR (MP4) スクリーニングアッセイを開発しました。私たちのアッセイの主な特徴は、最小限に処理された唾液、8 サンプルのペアプール、および SARS-CoV-2 ヌクレオカプシド遺伝子を標的とする逆転写液滴デジタル PCR (RT-ddPCR) の使用です。検出限界は、個々のサンプルとプールされたサンプルについて、それぞれ 1 μl あたり 2 コピーと 12 コピーであると決定されました。 MP4 アッセイを使用して、当社は 24 時間の所要時間で 1 日あたり 1,000 を超えるサンプルを定期的に処理し、17 か月間にわたって 250,000 を超える唾液サンプルをスクリーニングしました。モデリング研究では、8 サンプルプールの効率はウイルス感染率の増加に伴って低下し、これは 4 サンプルプールを使用することで軽減できることが示されました。また、ウイルス蔓延率が高い場合に採用する追加戦略として、3 番目のペアのプールを作成するための戦略とそれをサポートするデータのモデリングも示します。

新型コロナウイルス感染症（Covid-19）の世界的なパンデミックは、学校や大学などの複数の集団が集まる環境に、コミュニティの安全を確保しながら堅牢な教育プログラムを維持する方法など、大きな課題を突きつけました1。大学は、ほとんどの人がワクチン接種を受けていない時期である 2020 年の秋学期 (通常は 8 月から 12 月) の計画を立てる際に、さまざまな懸念事項を考慮しました 2,3,4。再開計画は、完全なリモートから完全な対面、あるいはその中間のアプローチまでさまざまでした5。対面での学習に戻る取り組みを促進するために、無症状の感染者を特定し、他の介入と組み合わせてSARS-CoV-26の蔓延を軽減するための定期的なスクリーニングが提案された。多くの大学が、さまざまな種類のサンプル (唾液 vs 鼻腔スワブ)、サンプル処理 (最小限 vs RNA 抽出)、効率戦略 (プール vs 非プール)、プラットフォーム (qPCR、RT-LAMP、抗原検査) を使用してスクリーニングアッセイを開発または実装しています。ただし、大部分は qPCR7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 に依存していました。 1,400の高等教育機関（IHE）を対象とした最近の分析では、広範な検査を実施した高等教育機関（IHE）では入院や死亡が少なかったため、これらのスクリーニング活動の成功がその所在地の郡にも広がっていることが示された23。

当社はコロラド州立大学のために唾液ベースのスクリーニングアッセイを開発し、キャンパスを安全に対面学習に再開する大学の取り組みの重要な要素として、2020年10月に導入されました。私たちの目標は、翌日の所要時間と感染の可能性のある人を検出して FDA 承認の検査に誘導するのに十分な感度を備えた、正確でハイスループット (1 日あたり約 1,000 サンプル) の唾液ベースのスクリーニングアッセイを実装することでした。ここで我々は、パンデミックに対する大学の対応の一環として開発したSARS-CoV-2核酸増幅アッセイについて報告する。これをマルチプレックス・ペアプールddPCR用のMP4アッセイと名付けた。

MP4 スクリーニングアッセイの概要を図 1 に示します。キャンパス全体のバーコード付きチューブに収集された唾液 (補足図 s1) は、宅配便によって研究室に運ばれ、すぐに 65 °C の水浴に 35 分間入れられました。 SARS-CoV-2 ウイルスを不活化します。次に、サンプルのバーコードが電子サンプルスプレッドシートにスキャンされました。バイオセーフティキャビネット内で、プレートあたり最大 64 個のサンプルとなるように、プロテイナーゼ K (PK) をあらかじめロードした 96 ウェルプレートの最初の 8 つのカラムに唾液サンプルを手動でピペットで移しました。短いインキュベーションステップの後、PK を熱不活性化し、2 つのペアのプールを構築しました。

MP4 スクリーニングアッセイの概要。無症状の成人からの唾液サンプルを収集し、熱不活化して、プロテイナーゼ K をあらかじめロードした 96 ウェルサンプルプレート (SP) のカラム 1 ～ 8 に個別にピペットで移しました。短いインキュベーションと PK 不活化ステップの後、2 つのペアのプール (文字と数字) ) は、「材料と方法」で説明したように作成されました。プールしたサンプルを、RT-ddPCR マスターミックスを含む PCR プレート (PP) に移しました。最大 5 つの SP (SP ごとに 2 カラム) のプールされたサンプルと、コントロールサンプルの 1 カラムを PP ごとに実行しました。自動液滴ジェネレーターで液滴を生成した後、cDNA 合成と増幅のために液滴をサーモサイクラーに移し、液滴リーダー (FAM/HEX チャネル) で液滴の蛍光を読み取りました。陽性液滴と陰性液滴を区別するための閾値は、対照サンプルを使用して設定されました。陽性プール (N1 液滴 3 個以上) には、個々のサンプルのデコンボリューションおよび確認検査のフラグが付けられました。図は BioRender.com で作成されました。

3%, Fig. 2B-E), the intersections identify “potential positive” samples that must be run individually to discriminate the true positives. The number of potential positive samples per plate not only depends on the number of true positive samples, but also on their spatial arrangement. As shown in Fig. 2C-E, which presents 3 different scenarios for plates with 3 positive samples per plate, the number of potential positive samples requiring reruns ranged from 3–9, depending on how those samples are arranged on the plate and therefore represented in the pools (Fig. 2F)./p> 3%) requires deconvoluting true positives (red) from potential positives (red and pink). (F) As the number of true positives (equal to the (greater of) the number of positive pools from either letter or number pools) increase on a sample plate, the number of potential positives (equal to the product of the number of positive letter pools times the number of positive number pools) increases. In rarer cases, a pool may contain several positives, which are surprisingly easy to identify (D, E)./p> 95% of samples./p> 10 N1 droplets in the corresponding pool; technical errors such as pipetting or the presence of inhibitors most likely account for these results./p> 10 lab personnel within this timeframe. Furthermore, the high degree of correlation between pools and individual samples (~ sevenfold difference) is very close to the predicted eightfold difference based on our pooling strategy as well as the sixfold difference in LOD concentrations observed between individual and pooled samples (2 and 12 copies per µl, respectively). We attribute part of the success of our pooling strategy, as well as the MP4 screening assay, to our reliance on manual processing of saliva samples, avoiding the use of automated liquid handling instruments in favor of manual inspection and pipetting, which allowed greater oversight over all steps of the assay. We and others experienced problems with automated pipetting of saliva due to viscosity and other issues21./p> 2% (Supplementary Fig. s7). The bulk of these days occurred at the end of 2020 (October-December) and during the Omicron wave at the end of December of 2021 through January of 2022. Although we did not change our pooling strategy during these peak prevalence periods, our modeling data suggests that either shifting to 4-sample pools or including a third pool would have been reasonable strategies (Figs. 7 & 10). 3D pooling would result in fewer pooled samples to test (32 pooled samples per plate for 2D pools/4 samples per pool versus 24 pooled samples for 3D pools/8-samples per pool). In general, any pooling will increase the efficiency of an assay (a measure of the reduction of the number of tests run as compared to running samples individually) (Supplementary Table s2) but will lower the sensitivity (i.e. increase the number of false negatives). As shown here and by others, both smaller pool sizes and 3D pooling are less susceptible to changes in positivity rates24. The optimal pooling strategy should be one that is flexible and can be adjusted according to changes in prevalence and viral loads within a population to maximize efficiency and sensitivity./p>

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